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药品微生物检验方法的应用探究

时间：2022-06-23 10:33 所属分类：医学论文 点击次数：

　　摘要：药品微生物指标超标直接影响药品使用者的安全与健康，故需对药品微生物进行检验，该文分析了药品微生物检验中的无菌检查法和限度检查法，结合注射用头孢抗生素无菌检查和妇科胶囊微生物限度检查介绍了此二法的应用。

　　关键词：药品;微生物检验;检验方法

　　药品用于治疗疾病，但被微生物污染的药品不但影响治疗效果，还会加重病情，而药品微生物检验是保证药品质量的重要手段[1]。药品微生物污染事件屡见不鲜，已严重影响用药安全，要保证药品微生物检验结果的准确离不开检验方法的选择和应用，例如微生物限度检查方法影响检查结果的准确性，方法适用性的确认是确保检查结果准确可靠的关键环节[2]。因此，本文对药品微生物检验的方法及应用进行了分析。

　　1 药品微生物检验的方法

　　1.1 无菌检查法

　　要求无菌的药品必须进行无菌检查，所谓无菌检查即按照无菌检查标准及规定的检验条件检查是否有微生物污染。无菌检查要求严格的无菌条件，并且操作的全过程都达到无菌要求，在这样的情况下仍检不出供试品内含有微生物判为合格。为了满足无菌条件，应按相关标准验证和确认洁净度，即监测单向流空气区域、工作台面、环境中的悬浮粒子、浮游菌、沉降菌数量符合A级洁净度要求。对药品进行无菌检查需验证检查方法的适用性，且药品及检验程序发生变化可能影响检验结果时需重新验证适用性。验证适用性需对菌种及菌液制备、检查方法(薄膜过滤法或直接接种法)进行试验，并按相关要求判断结果。《中国药典》2020年版三、四部对无菌检查的检验数量、检验量、阳性对照、阴性对照、供试品处理及接种营养基、结果判断作了明确规定。例如注射剂批产量在101～500个时，接种每种培养基的最少检验数量为10个;供试品最少检验量在供试品装量为41～100ml时，每支供试品接入每种培养基的最少量为20ml;抗革兰氏阳性菌的供试品阳性对照菌为金黄葡萄球菌;采用薄膜过滤法;在培养基规定的温度培养至少14天;供试品管澄清或有浑浊但经确认无菌生长即合格。

　　1.2 微生物限度检查法

　　微生物限度检查用于非无菌药品微生物污染程度的检查，检查项目包括需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数和控制菌，要求需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数不得超过限度标准规定，控制菌不得检出。微生物计数法用于需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数的检查，试验环境应符合微生物限度检查要求，试验全过程必须在无菌环境下进行，并定期监测单向流空气区域、工作台面、环境，要求洁净度1万级以下局部100级。检查时，供试品有抗菌活性必须清除或灭活。计数法包括平皿法、薄膜过滤法、MPN法，可根据供试品理化特性、微生物限定标准选择其中一种计数方法。计数法所使用的培养基和方法要进行适用性试验，药品及检验程序改变时还要进行适用性试验。适用性试验要求菌株传代次数不得超过5代，并按规定程序制备菌液，为确认试验条件的符合性要进行阴性对照试验。验证培养基的适用性，应按要求进行试验，内容包括供试液制备、接种和稀释、去除或灭活抗菌活性、微生物回收试验，并按要求判断结果。检验量以随机抽取不少于2个最小包装的供试品，一般为10g或10ml，膜、贴、膏等剂型为100cm2或不少于4片，大蜜丸不少于4丸，贵重、微量包装可酌减，如1mg或1ml。控制菌法要检查的致病菌包括大肠埃希菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、耐胆盐革兰氏阴性菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、生孢梭菌等。控制菌法只要检出致病菌即判断不合格，不需要复试。该法对试验环境及供试液制备的要求与计数法一致，即在全程无菌环境下进行试验。供试品有抗菌活性要去除或灭活。试验所用培养基要进行适用性试验，药品或检验程序变化也要进行适用性试验。致病菌株的传代次数同样要求不超过5代，在规定的培养基上培养和制备菌液，并通过阴性对照验证试验条件的符合性，包括培养基促生长能力、抑制能力、指示特性。方法适用性试验按微生物限度标准规定选择试验菌，再接入培养基中，在规定的试验条件下进行培养，供试品检查时要做阳性对照和阴性对照，并可进行定性试验或定量试验。

　　2 药品微生物检验方法的应用

　　2.1 注射用头孢抗生素无菌检查方法的应用

　　供试品规格0.5g，由生产注射用头孢抗生素企业提供。标准菌种有生孢梭菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉等，由食品药品检定研究机构提供，为第2代工业用菌株。按照《中国药典》2020年版四部通则1101无菌检查法进行适用性试验，制备浓度小于100CFU/ml的菌液。抽取供试品，以250ml 0.9%无菌NaCl溶液溶解，成为浓度60mg/ml的供试液。采用薄膜过滤法过滤供试液，以0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗5次，每次100ml，最后一次加入供试菌液。分别在金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌供试品管内加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，并加入50万单位头孢菌素酶，在30～35℃培养。分别在白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉供试品管内加入100ml胰酪大豆胨琼脂培养基，并加入50万单位头孢菌素酶，在20～25℃培养。培养期间。每日观察记录。将试验菌液分别加入到100ml硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基中，按照前述操作进行阳性对照。不加供试液及供试菌，其他操作同前进行阴性对照。适应性试验结果表明培养基及检验方法符合药典规定，再以供试液进行无菌试验，供试品管澄清，判断供试品合格。

　　2.2 妇科胶囊微生物限度检查方法的应用

　　某妇科胶囊含有熟地、茯苓、阿胶、白芍等中药，用于治疗绝经期各种妇科疾病。标准菌种有大肠埃希菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉等，试验菌株为第3代。按照《中国药典》2020年版四部通则1105进行微生物限度检查。制备浓度(5～10)×103CFU/ml的菌液。取10g样品，以100ml无菌NaCl-蛋白胨缓冲液(调pH值为7.0)稀释成供试液(1:10)。以类似方法制备供试液(1:50)。取9.9ml供试液+0.1ml菌液，采用平皿法计数，结果供试液(1:10)对铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌回收比均小于0.5.而供试液(1:50)对铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌回收比均大于0.9.供试液(1:10)对白色念珠菌、黑曲霉回收比均大于0.8.以上情况说明供试品对需氧菌有抑菌作用，应采用稀释比例(1:50)，而供试品对酵母菌及霉菌无抑菌作用，可采用常规比例(1:10)。控制菌检查，供试液(1:10)对大肠埃希菌、沙门菌、耐胆盐革兰氏阴性菌阳性对照结果为阳性，阴性对照结果和供试品均为阴性，说明供试品对控制菌无抑菌作用，可采用常规比例(1:10)。

　　3 结语

　　药品微生物检验是保障药品安全的关键环节，根据对药品微生物要求的不同，无菌药品适用无菌检查法，非无菌药品适用微生物限度检查法，虽然两种方法均要求在无菌环境下试验，但操作方法却不同，应按各自的适用性试验结果选择培养基及试验参数，以确保检验方法的科学合理。

　　参考文献：

　　[1]杨娟,钟昕,朱世真,等.测量不确定度在微生物检验中的应用及研究进展[J].生物化工,2021.7(4):119-123.

　　[2]蔡静,赵状.基于CNKI期刊文献的药品微生物检验研究热点分析[J].中国医药导刊,2020.22(5):340-343.